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    miRNA的逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR

    發(fā)布時間: 2024-05-07  點(diǎn)擊次數(shù): 678次

    microRNA(miRNA)是一種長度約為19-25nt單鏈RNA,一般參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)。作為非編碼RNA(ncRNA),目前大量的研究顯示一些差異表達(dá)miRNA在眾多的疾病中扮演著重要的角色,而了解miRNA差異表達(dá),熒光定量PCR是最基礎(chǔ)、應(yīng)用最多的檢測和定量miRNA的方法。


    由于miRNA的長度比較短,因此傳統(tǒng)的熒光定量并不適用,下面介紹的兩種方法的最根本的原理其實(shí)就是延長miRNA.因此在這里分享了關(guān)于miRNA進(jìn)行qPCR的兩種方法和一些經(jīng)驗(yàn)總結(jié):


    一、提取細(xì)胞、血清或外泌體RNA

    就目前而言,針對不同樣品TRIZOL法提取RNA是比較通用的提取RNA的試劑,但是也具有相應(yīng)的提取試劑盒(血清RNA提取試劑盒),目前一般均使用的是TRIZOL法提取的total RNA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn),但有文獻(xiàn)說明TRIZOL法可能會導(dǎo)致miRNA丟失,也可選擇miRNA提取試劑盒。


    二、miRNA的qPCR

    1.miRNA莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄 + miRNA熒光定量PCR

    原理:在逆轉(zhuǎn)錄過程中我們需要設(shè)計(jì)一個莖環(huán)引物與我們miRNA序列結(jié)合起到延長miRNA的作用。而莖環(huán)引物是一個長度約為45bp且能夠自身環(huán)化的引物。每一個miRNA都具有自己特異的莖環(huán)引物。這最重要的原因就是設(shè)計(jì)的莖環(huán)引物中包含一段與miRNA互補(bǔ)序列有關(guān):莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物 =5’端的莖環(huán)序列+3’端的miRNA的特定互補(bǔ)序列。


    ①莖環(huán)引物的設(shè)計(jì):

    首先我們在miRBase數(shù)據(jù)庫中查詢到miRNA的成熟序列(5’-3’),利用excel中的替換功能將序列中的U全部換成T,一般地通用的莖環(huán)引物序列如CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGC3’ 或者5’GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC3’,紅色部分的序列可形成自身環(huán)化。

    另外,針對特定miRNA設(shè)計(jì)的莖環(huán)引物:只需要在通用莖環(huán)引物3’端加上miRNA的成熟序列中的U更換成T后的序列3’端開始數(shù)6-8個堿基(一般選擇6個)的反向互補(bǔ)序列加在莖環(huán)通用序列的3’端即可,這樣就得到某個miRNA的莖環(huán)引物。

    以hsa-miR-30b-5p為例,其成熟序列為UGUAAACAUCCUACACUCAGCU,U全部換成T:TGTAAACATCCTACACTCAGCT;則其莖環(huán)引物為:5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGCTGA-3′

    ②逆轉(zhuǎn)錄(RT):去除基因組DNA + 逆轉(zhuǎn)錄(可使用miRNA專用的莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒)

    1)去基因組DNA(2ul基因組去除試劑);

    2)RNA體積:根據(jù)提取RNA濃度來定+free-RNase H2O(to 10ul);

    3)吹打混勻,42度反應(yīng)2min;

    4)逆轉(zhuǎn)錄:1ul莖環(huán)引物(stem-loop)+試劑盒中逆轉(zhuǎn)錄MIX(2ul+2ul)+free-RNase H2O(5ul)(to 20 ul)

    5)一般來說,一次逆轉(zhuǎn)錄只能進(jìn)行一個miRNA的單獨(dú)逆轉(zhuǎn)錄,但是根據(jù)實(shí)際情況而言,我們可以將miRNA+內(nèi)參U6混合在一管中一同逆轉(zhuǎn)成cDNA。

    根據(jù)以上試劑盒設(shè)計(jì)的加樣量,我嘗試過一管內(nèi)混合逆轉(zhuǎn)錄內(nèi)參+5個miRNA,其中主要的變化就是在第一步增大所加入RNA的量,在第二步加莖環(huán)引物時,我們可以將所加入的free-RNase H2O(5ul)替換成不同的莖環(huán)引物(5個),這種方式在特異性的基礎(chǔ)上又比較高效的合成多個miRNA,雖然節(jié)省試劑,但是也存在弊端,例如我們加入Mix(包含酶或dNTP等)都是一定量的,加入過多的莖環(huán)引物合成最終的各種miRNA的cDNA產(chǎn)物可能存在濃度過低,混合不勻可能會影響后續(xù)的熒光定量。

    ③熒光定量(qPCR)

    1)熒光定量引物的設(shè)計(jì):由于莖環(huán)引物存在一段通用序列,因此使用的反向引物(下游引物)一般也是通用的且試劑盒會配備有,此時我們只要設(shè)計(jì)特異的正向引物(上游引物),在遵循引物設(shè)計(jì)原則(長度18-26bp;GC含量:40%-60%;Tm:55-60℃)的基礎(chǔ)上,正向引物=自身成熟序列去除莖環(huán)引物中的6個堿基5’-3’端剩下的堿基:正向引物:TGTAAACATCCTACAC,但是一般我們會對引物進(jìn)行調(diào)整,與下游引物的Tm值相適應(yīng),調(diào)整熒光定量PCR的引物長度在5’端增加堿基C/G。莖環(huán)序列為:


    5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGCTGA-3′,則通用反向引物為:5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′

    2)熒光定量:10ul體系(20ul體系減半)(SYBR染料法):

    5ulSYBR+1ulcDNA+2ulfree-RNase H2O+2ul正反引物(提前混合)

    例如:RT-qPCR分析hsa-miR-30b-5p的差異表達(dá)水平,以U6為內(nèi)參:

    對照組+處理組:此時為了減小誤差bar的大小做4個復(fù)孔,以八聯(lián)管為例:

    miRNA的逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR

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