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    補(bǔ)骨脂素介導(dǎo)的光交聯(lián)反應(yīng)研究RNA與蛋白質(zhì)分子間的作用實(shí)驗(yàn)

    發(fā)布時間: 2022-03-24  點(diǎn)擊次數(shù): 1213次

    材料與儀器

    蛋白酶K
    變性膠電泳緩沖液 非變性膠電泳緩沖液 結(jié)合緩沖液 水解緩沖液 丙烯酰胺儲存液 RNA 洗脫緩沖液四甲基乙二胺 過硫酸銨 AMV 反轉(zhuǎn)錄酶及反應(yīng)緩沖液 磷酸鈉 8-羥基補(bǔ)骨脂素 1 3-二碘丙烷 碳酸鉀 丙酮 石油醚 乙酸乙酯 硫酸鈉 硅膠 三Fyi suan水溶液 二甲基甲酰胺
    聚丙烯酰胺凝膠電泳 光化學(xué)反應(yīng)裝置 Sep-pak C18 膠片 旋轉(zhuǎn)真空干燥儀 Sigmacote X 射線片

    步驟

    一、材料與設(shè)備

    1. 聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置。

    2. 光化學(xué)反應(yīng)裝置(360 nm 長波長):建議采用 Rayons RPR-100 光化學(xué)反應(yīng)裝置 ( The Southern New England Ultraviolet Company,Branford,USA )。其他紫外光源 ( 如 Stratalinker ) 也都可以使用。此外,長波長的手提紫外燈(如 Model UVGL-25, San Gabriel,CA,USA ) 也適用于交聯(lián)反應(yīng),但需要照射較長吋間。

    3. Sep-pak C18 膠片,購自 Waters ( MiIford,MA,USA)公司。

    4. 旋轉(zhuǎn)真空干燥儀。

    5. Sigmacote ( 可購自 Sigma 公司,St. Louis,MO,USA;為 Sigma 公司的一種硅烷化試劑)。

    6. 變性膠電泳緩沖液(TBE):0.09% mol/L Tris-硼酸,0.002 mol/L EDTA。配制 5X TBE 儲存液:取 900 ml 雙蒸水溶解 54 g Tris 和 27.5 g 硼酸,加入 20 ml 的 0.5 mmol/L EDTA ( pH 8.0 ) 定容 1L, 高壓滅菌后保存。

    7. 非變性膠電泳緩沖液:含 0.1% Triton X-100 的 TBE 緩沖液。

    8. 1X 結(jié)合緩沖液:50 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.5),20 mmol/L KCl,0.1% Triton X-100。

    9. 10X 水解緩沖液:等體積混合 0.5 mol/L Na2CO3 和 0.5 mol/L NaHCO3 ( pH 9.2 )。

    10. Nase T1,RNase T1 緩沖液:16 mmol/L 檸檬酸鈉(pH 5.0 ),0.8 mmol/L EDTA,0.5 mg/mL tRNA,3.5 mol/L 尿素。

    11. Nase B cereos,Nase B cereos 緩沖液:16 mmol/L 檸檬酸鈉(pH 5.0 ), 0.8 mmol/L EDTA,0.5 mg/ml tRNA。

    12. 電泳上樣緩沖液:9 mol/L 尿素,1 mmol/L EDTA,0.1% 溴酚藍(lán)或 98% 甲酰胺。1 mmol/L EDTA,0.1% 溴酚藍(lán);非變性電泳上樣緩沖液:50 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.5),20 mmol/L KCl,0.1% Triton X-100,40% ( m/V ) 甘油,0.1% 溴酚藍(lán)。

    13. 40% (m/V) 丙烯酰胺儲存液:380 g 丙烯酰胺,20 g 甲叉雙丙烯酰胺,定容至 1 L,過濾后 4°C 保存。變性膠工作液中含 7 mol/L 尿素和 1X TBE;非變性膠工作液中含 0.1% Triton X-100 和 1X TBE。

    14. RNA 洗脫緩沖液:TBE 緩沖液 ( pH 7.2 ) ( 以 0.1 mol/L HCl 調(diào) pH )。

    15. 四甲基乙二胺(TEMED) 和過硫酸銨。

    16. 補(bǔ)骨脂素修飾的多肽或蛋白分子,5' 或 3' 末端標(biāo)記 32P 的 RNA。

    17. AMV 反轉(zhuǎn)錄酶及反應(yīng)緩沖液(購自 Promega 公司)。

    18. 放射自顯影所需的 X 射線片,壓片盒及圖像處理儀器等。

    19. 蛋白酶 K 及反應(yīng)緩沖液:10 mmol/L Tris-HCI ( pH 7.8 ),5 mmol/L EDTA 和 0.5% SDS。

    20. 8-羥基補(bǔ)骨脂素,1,3-二碘丙烷,碳酸鉀,丙酮,石油醚,乙酸乙酯,硫酸鈉,硅膠 ( 購自 Aldrich 公司 )。

    21. 0.1 mol/L 磷酸鈉(pH 7.4 )。

    22. 10% 三Fyi suan水溶液。

    23. 二甲基甲酰胺。

    二、操作方法

    1. 同半胱氨酸反應(yīng)的補(bǔ)骨脂素合成

    即合成 1 號化合物:8-[ ( 3碘丙基-1 )氧 ]補(bǔ)骨脂素 [ 8-[ ( 3-iodopropyl-1) oxy] psor-alen ]。

    (1) 在 100 ml 的腳底燒瓶內(nèi)將 8-羥基補(bǔ)骨脂素(0.176 g,1 mmol ),1,3 -二碘丙烷 ( 1.15 ml,2.96 g,10 mmol ) 和碳酸鉀(1.38 g,10 mmol ) 溶解于 15 ml 丙酮中。

    (2) 混合物于室溫振搖 10 h,薄保層析法對反應(yīng)進(jìn)行檢測(展開劑:石油醚:乙酸乙酯,4:1 )。反應(yīng)*時無起始物質(zhì)。

    (3) 真空濃縮燥反應(yīng)物。

    (4) 30 ml 水溶解干燥產(chǎn)物,以 20 ml 乙酸乙酯萃取 3 次。

    (5) 用 30 ml 水洗萃取產(chǎn)物,再用 10 ml 飽和氯化鈉洗 1 次萃取產(chǎn)物。

    (6) 加入約 2 g 硫酸鈉,室溫放置 4~6 h。

    (7) 以硅膠對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行層析,石油醚:乙酸乙酯(4 : 1 ) 洗脫產(chǎn)物。純化得到的 1 號化合物(0.31 g ,產(chǎn)率為 85% ) 為淡黃色固體。

    2. 補(bǔ)骨脂素與蛋白結(jié)合

    (1) 通過定點(diǎn)突變或固相合成多肽將活性半胱氨酸插入到蛋白的特定位置。

    (2) 對蛋白進(jìn)行純化和特性檢測之后將蛋白 (1 nmol ) 和前面制備的 1 號化合物 (10 nmol ) 一同溶解于 100 μl 二甲基甲酰胺。

    (3) 加入 50 μl 0.1 mol/L,pH 7.4 的磷酸鈉緩沖液,調(diào) pH 至 7.0。

    (4) 室溫放置 16 h。

    (5) 在反應(yīng)液中加入約 10 μl 10% 三Fyi suan水溶液調(diào)節(jié)溶液的 pH 至 4.0~5.0 之間。

    (6) 用 0.5 ml 氯仿提取未反應(yīng)的補(bǔ)骨脂素,重復(fù) 3 次。

    (7) 用 0.2 ml 1% 三Fyi suan水溶液洗有機(jī)相 3 次,回收溶解的多肽。

    (8) 合并水相,在旋轉(zhuǎn)真空濃縮儀中將總體積濃縮至約 200 μl。

    (9) 通過 TIPLC ( 采用 Zorbax 300 SB-C8 column 或其他適用于所研究的蛋白的柱料)純化結(jié)合補(bǔ)骨脂素的蛋白。所得到的結(jié)合了補(bǔ)骨脂素的蛋白的產(chǎn)率通常為 80% 左右。

    3. 光交聯(lián)

    (1) 小量交聯(lián)反應(yīng)

    在進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)前先制備變性聚丙烯酰胺凝膠(含 1X TBE 和 7 mol/L 尿素)。

    將制備好的凝膠以 30W 功率預(yù)電泳 3~4 h。

    將末端標(biāo)記了 32P 的 RNA 溶解于 20 μl 結(jié)合緩沖液中(終濃度約為 2.5 μmol/L ), 85℃ 加熱 3 min 使 RNA 變性,再讓其逐漸冷卻至室溫,使 RNA 再折疊。

    取 2 μl RNA,2 μl 5X 結(jié)合緩沖液,1 μl 0.1 μg/μl 酵母 tRNA,1~5 μl 雙蒸水,再加入結(jié)合了補(bǔ)骨脂素的蛋白,終體積為 10 μl ( 加入的蛋白量可通過凝膠電泳分析,選取合適的 RNA/蛋白比率)。

    將反應(yīng)液混勻,冰浴 20 min;同時用 95% 乙醇擦洗一個干凈的小玻璃平板,用 Sigmacote 硅化,從而更好的回收交聯(lián)后的樣品,將平板罝于冰上。

    將準(zhǔn)備好的樣品轉(zhuǎn)移到平板上,紫外照射(360 nm)10 min 至 20 min ( 最佳照射時間需根據(jù)時間-效成曲線判定)。

    將照射后的樣品轉(zhuǎn)移至一個新的小管內(nèi),以 10 μl 上樣緩沖液沖洗平板上殘留的樣品斑點(diǎn)后也合并入小管內(nèi)。

    再向經(jīng)照射的樣品中加入 10 μl 上樣緩沖液,再在所有的樣品中加入 1 μl 20 μg/μl 酵母 tRNA 競爭 RNA 蛋白的結(jié)合。

    所有的樣品于 90°C 加熱 3 min,上樣電泳,以 30W 功率電泳 2~4 h,直至溴酚藍(lán)前沿距膠底部 5 cm 位置。

    拆膠后用保鮮膜包裹,于 -80℃ 放射自顯影。

    (2) 大量交聯(lián)的制備

    確定 RNA 分子上的交聯(lián)位點(diǎn)時需要大量的交聯(lián)反應(yīng)。前面提及的交聯(lián)反應(yīng)可以擴(kuò)大 100 倍甚至更大,而終體積卻可以縮小至原先的一半。在紫外照射交聯(lián)時,為保證交聯(lián)效率和便于操怍,點(diǎn)在平板上的樣品最好不要多于 20 μl。

    電泳膠的制備同前所述,同樣需要預(yù)電泳。

    在紫外照射后,用 1/10 體積 3 mol/L NaAc ( pH 5.2 ) 和 2.5 倍體積的無水乙醇于 -80℃ 放置 30 min 以沉淀 RNA 和 RNA 交聯(lián)物。

    于 16000 g 離心 20 min 去上淸,用少量的 75% 乙醇洗沉淀,再次離心去上淸。真空抽干。

    用上樣緩沖液重懸產(chǎn)物,加入酵母 tRNA,90℃ 加熱 3 min,上樣電泳,同時在旁邊上樣孔內(nèi)加入末端標(biāo)記的 RNA 作為對照。

    拆膠后用保鮮膜包裹,于室溫放射自顯影(時間較短)。

    對照放射自顯影的結(jié)果切下 RNA 和交聯(lián)物,搗碎,用 RNA 洗脫緩沖液洗脫,乙醇沉淀冋收。

    4. 確定交聯(lián)位點(diǎn)

    可以通過對純化的 RNA 交聯(lián)物進(jìn)行 RNase 不*消化和堿水解反應(yīng)來確定 RNA 上的交聯(lián)位點(diǎn)。片段的大小可以通過與已知序列和長度的寡核苷酸(經(jīng) RNasc T1 和 RNase B. cereus 消化的 RNA ) 進(jìn)行比較來確定。

    對于大量的或結(jié)構(gòu)不穩(wěn)足的且不適于堿水解的 RNA,可以通過對純化的 RNA 交聯(lián)物進(jìn)行引物延伸分析來找到 RNA 上的精確的參與交聯(lián)的位點(diǎn)。以 RNA 為模板反轉(zhuǎn)錄合成的 cDNA 拷貝終止于 RNA 的修飾位點(diǎn)或交聯(lián)位點(diǎn),通過與對照序列的比較就可以找到反轉(zhuǎn)錄的終止位點(diǎn)。

    (1) 不*堿性水解反應(yīng)確定 RNA 交聯(lián)位點(diǎn)

    將 32P 標(biāo)記的 RNA 分別加入兩個干凈的離心管內(nèi),標(biāo)號 No.one,No.2; 將 RNA-蛋白交聯(lián)物加入第三個離心管,標(biāo)號 No.3。

    在 No.noe 管中加入 1 μl 10X RNase 緩沖液,1 μl 0.1 U/μl 的 RNase T1 或 RNase B. cereus,加雙蒸水至 10 μl,55℃ 孵育 6~12 min 。此反應(yīng)是水解反應(yīng)的片段大小對照。

    另兩管加入 1 μl 10X 水解緩沖液,再加雙蒸水至10 μl,85℃ 孵育 8 min 得到 RNA 的堿水解片段。

    三管均加入了上樣緩沖液,置于冰上,于 95℃ 加熱 2 min,上樣,變性膠電泳(膠已經(jīng)以 30W 預(yù)電泳 4 h ) 至所有條帶得到充分分離。

    放射自顯影。

    (2) 反轉(zhuǎn)錄(引物延伸分析)法確定 RNA 交聯(lián)位點(diǎn)

    此方法中通常的 RNA 或 RNA 蛋白交聯(lián)物的用量為 0.1~1 pmol (具體用量取決于 32P 標(biāo)記的 DNA 引物的活性)。

    用蛋白酶 K 消化 RNA-蛋白交聯(lián)物,生成的 RNA-蛋白交聯(lián)物中的多肽僅含存較少的氨基酸:用 50 μl 蛋白酶 K 反應(yīng)緩沖液重懸從膠中純化得到的 RNA-蛋白交聯(lián)物,加入 1 μl 蛋白酶 K 儲存液(2.5 mg/ml ),于 37℃ 反應(yīng) 30 min。

    乙醇沉淀 RNA-蛋白交聯(lián)物(方法同前),變性膠電泳純化 RNA 產(chǎn)物(方法同前)。

    在反應(yīng)管中加入 4 pmol 未交聯(lián)的 RNA,4 pmol 32P 標(biāo)記的 DNA 引物,2 μl 5X 反轉(zhuǎn)錄緩沖液,雙蒸水補(bǔ)充體積至 10 μl。另一反應(yīng)管內(nèi)加入消化后的 RNA-蛋白交聯(lián)物,1 pmol 32P 標(biāo)記的 DNA 引物,0.5 μl 5X 反轉(zhuǎn)錄緩沖液,雙蒸水補(bǔ)充體積至 2.5 μl。75°C 退火 3 min,漸冷卻至室溫,離心收集產(chǎn)物。

    分別以 G、A、C、U 和 X 標(biāo)記五個反應(yīng)管,均加 3 μl 核苷酸混合物,1 μl 5X 反轉(zhuǎn)錄緩沖液,在 G、A、C、U 各管中加入 2.5 μl 步驟(3)中未交聯(lián)的 RNA 混合液,將步驟(3)中 RNA-蛋白交聯(lián)物的混合液加入反應(yīng)管 X。

    在每個反應(yīng)管中加入 1 μl ( 5 U/μl ) AMV反轉(zhuǎn)錄酶,起始延伸反應(yīng)。

    室溫溫育 10 min,于 42℃ 溫育 50 min。

    向每個反應(yīng)管中加入 12 μl 上樣緩沖液終止反應(yīng),95℃ 加熱 5 min,進(jìn)行變性膠電泳。

    放射自顯影。

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