国产69精品久久久久孕妇,午夜dj影院免费直播观看完整版 ,妞干网这里只有精品,羞羞软件下载

銷售熱線

19126518388
  • 技術(shù)文章ARTICLE

    您當前的位置:首頁 > 技術(shù)文章 > 哺乳動物細胞瞬時基因轉(zhuǎn)移法制備重組蛋白實驗

    哺乳動物細胞瞬時基因轉(zhuǎn)移法制備重組蛋白實驗

    發(fā)布時間: 2022-03-14  點擊次數(shù): 1155次

    材料與儀器


    步驟


    一、轉(zhuǎn)染方法

    對于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 (Upofection), 可以從商業(yè)途徑獲得許多配方,這些配方都具有單一的專(禾刂)化組分,而且毫無疑問,它們中的大部分都能非常有效地將質(zhì)粒 D N A 轉(zhuǎn) 人 細 胞 。其缺點是價格不菲—- 在使用這些試劑時,對于超出數(shù)百毫升規(guī)模的瞬時轉(zhuǎn)染,經(jīng)濟上是不可行的。大規(guī)模的瞬時轉(zhuǎn)染方法要求轉(zhuǎn)染試劑能很容易大量獲取, 批次間的變化小以保證轉(zhuǎn)染的一致性。盡管也存在一些其他的選擇,如將殼聚糖 (chitosan) 及其衍生物和14D E A 2 作為轉(zhuǎn)染試劑(D a n g and L e o n g , 2006; Jiang and Sharfstein, 2008; K u s u m o t oet a L , 2 〇〇 6),但磷酸鈣(calcium phosphate) 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染以及基于聚乙烯亞胺 (polyethylenimine,PEI) 的質(zhì)粒絡(luò)合 (plasmidcomplexation) 和細胞攝人是僅有的滿足這些要求的兩種常用技術(shù)。

    1.利 用 聚 乙 烯 亞 胺 在 W a v e ™ 生物反應(yīng) 器 中 進 行 大 規(guī) 模 瞬 時 轉(zhuǎn) 染

    近些年 ,一 次 性的 W a v e ™ 生物反應(yīng)器得到了普遍的認可,因為相對于經(jīng)典的攪拌釜反應(yīng)器,其保養(yǎng)和操作更加容易。雖 然 100 L 工作體積的反應(yīng)器也實現(xiàn)了商業(yè)化,擁有300 L 工作體積的樣機也在開發(fā)之中, 但最為常用的反應(yīng)器的工作體積是 10 L 和 20 L 。是否 使用 W a v e ™ 生物反應(yīng)器進行 10 L 以下的轉(zhuǎn)染取決于經(jīng)濟可行性—我們更傾向于使
    用搖瓶進行小規(guī)模的生產(chǎn) ( F e m b a c h flasks, Corning)。據(jù)報道,也有其他的反應(yīng)器或振搖設(shè)備成功的用于瞬轉(zhuǎn)培養(yǎng)(Muller et al. , 2005; P h a m et aL , 2006; Stettler et al.,2007)。

    下面介紹以 H E K 293 T 細胞為宿主,使 用 M 11V 3 無血清培養(yǎng)基 (Novartis proprietary) 進行 10 L 規(guī)模的抗體生產(chǎn)的方法。 抗體的兩條鏈都克隆至同一個表達載體。

    (1) 將一個 20 L 的 W a v e ™ 袋(Sartorius Stedim Biotech, G 6ttingen, G e r m a n y ) 安裝 到 W a v e ™ 工 作 平 臺(W a v e - Bioreactor S P S 5O ) ,并連接到一個 D A S G I P 氣體混合模塊上(D A S G I P , Juelich, G e r m a n y )。然后,在 袋 中 接 種 4 L H E K 293T 細胞培養(yǎng)物,細胞密度約 為 I.8 X IO6 個細胞/m L 。

    (2) 我 們 采 用 了 下 列 過 程 參 數(shù) 和 條 件 : 氣 體 流 速 2 〇 L /h ; 混 合 氣 體 包 括 2 1 % ?2 5 % 〇 2、0 % C O 2; 溫度 37°C ; p H 6. 8?7, 4; 搖擺速率 10 r Z m i n; 搖擺角度 7°

    (3) 將 10 m g 質(zhì) 粒 D N A (1 m g /m L ) 與 M 11V 3 培養(yǎng)基混合至終體積為 500 m L , 室溫孵育 10 m i n 。然 后 ,用 0. 22 p m 的 G P E X P R E S S P L U S 濾 膜(Millipore, Billerica,
    M A ) 將稀釋后的 D N A 溶液過濾除菌。

    ⑷ 將 3 〇 m L P E I 溶 液(I m g /m L ) 與 500 m L M l l V 3 培 養(yǎng) 基 混 合 ,室溫孵育10 m i n 。然后 用 0.22um 的 G P E X P R E S S P L U S 濾膜將稀釋后的 P E I 溶液過濾除菌。

    注意:P E I 儲存液在使用前是應(yīng)當無菌的,經(jīng)過過濾的,分 裝 并 凍 存 于 一 80°C 直至使用。

    (5) 接下來,將 P E I 溶液加至 D N A 溶液中,室溫孵育 15 m i n 以形成多聚絡(luò)合物。

    (6) 無菌條件下,將 D N A -P E I -M 11V 3 混合物加至 W a v e ™ 袋中的細胞培養(yǎng)物中, 終體 積 為 5 L 。繼續(xù)用下列參數(shù)孵育 5?6 h : 氣體流速 M L /h ; 混合氣體包括 2 5 % O 2、〇 %CO2; 溫度 37°〇 ; 口 1^6.8?7.4; 搖擺速率 1 〇 r/min; 搖擺角度 7°。

    (7) 然后,向 5 L M 11V 3 培養(yǎng)基中補加 100 m L R X l 組合補料 (補料含有氨基酸、葡萄 糖 和 谷 氨 酰 胺 ;由 Irvine Scientific, Santa A n a , C A 定 做),無 菌 條 件 下 將 其 加 至W a v e ™ 袋的細胞中。在生產(chǎn)期,采 用 如 下 參 數(shù) : 氣 體 流 速 30?40 L /h ; 混合氣體包括3 〇 %?4 〇 % O 2、0 % C O 2; 溫 度 37°C ; p H 6. 8?7.4(用 p H 9.2 的碳酸氫鹽溶液調(diào)整,Sigm a Aldrich, B u c h s , Switzerland); 氣體飽和度 6 0 % ?100%; 搖擺速 率 14?18 r/mi. n ; 搖擺角度 7°。

    (8) 轉(zhuǎn)染的細胞在 W a v e ™ 生物反應(yīng)器中培養(yǎng) 10 天 ,以生產(chǎn)抗體。
    注 意 : 為了生產(chǎn)重組蛋白,生 產(chǎn) 期 通 常 為 5?7 天 ,但如果目標蛋白質(zhì)對蛋白酶解敏感 ,這個時間可以縮短??贵w分子的生產(chǎn)時間可延長至 1 0 天 。

    (9) 每天取樣,用 V 1 -Cell 細 胞 計 數(shù) 設(shè) 備(B e c k m a n Coulter) 測定細胞密度和成活率 。用 Bioprofile 400 分析儀 (Labor-Systeme Fliickiger, Switzerland) 測定營養(yǎng)狀態(tài)、p H
    及氣體飽和度。用 蛋白 A 高壓液相測定 I g G 濃度(圖 15. 1)。

    (10) 10 天后,在無菌條件下收集細胞,橫流過濾(cross-flow filtration) (FreseniusFilter P l a s m a F l u x, 0.2 fim) 以 除 去 細 胞 。然 后 將 無 細 胞 的 上 清 液 用 中 空 纖 維 過 濾(hollow fiber filtration)(H e m o f l o w F 10 H P S , Fresenius, Stans, Switzerland, 10 k D acutoff) 的方法濃縮 10 倍 。

    (11) 用 Protein A 親和色譜和分子篩色譜對濃縮液進行純化。對上述這些標準方法有多種改進, 這些改進后的方法已經(jīng)經(jīng)過測試并發(fā)表,其中的一些在下面簡短列出。

    ① 在 利用 C H O 細胞系進行生產(chǎn)的過程中,通過轉(zhuǎn)換溫度至 30?32°C 提高表達速率(Backliwal et al. , 2008a ; Galbraith et al. , 2006)。

    ② 用微管解聚劑諾考達唑(nocodazole) 處 理 細 胞 使 其 細 胞 周 期 停 滯 在 G 2/M 期(Tait et a L , 2004)。

    ③ 用抑制劑,如丁酸鈉(sodium butyrate)、丙 戊 酸(valproic acid) 處 理 去 抑 制 C H O和 H E K 293 細胞的組蛋白脫乙酰基酶(histone deacetylase) 及 D N A 甲基轉(zhuǎn)移酶(D N Amethyl transferase) (Backliwal et al. , 2008c)。

    ④ 對細胞系進行遺傳改造,以阻止凋亡 (apoptosis) 或克服未折疊蛋白質(zhì)應(yīng)答 (unfolded protein response,U P R ) 造成的抑制作用(Backliwal et al. , 2008c; Majors et al. ,2007; Tigges and Fussenegger, 2006) ?

    結(jié)論

    正如該領(lǐng)域中已經(jīng)發(fā)表的大量數(shù)據(jù)所反映的那樣, 過去幾年,就技術(shù)發(fā)展和產(chǎn)量而言 ,通過瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)制備重組蛋白已經(jīng)達到了一個令人印象深刻的狀態(tài)。不過,盡管有報道指出,利用大規(guī)模瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)在生物反應(yīng)器中生產(chǎn)蛋白質(zhì),已能獲得相當高的抗體滴度—大 于 I g / W B a c k l i w a l et al. , 2008a),但現(xiàn)在就想用它替換過程繁瑣的構(gòu)建細胞系方法用于生物治療藥物的生產(chǎn)還為時尚早。我們通過對 1 〇〇多個瞬時轉(zhuǎn)染表達實驗的觀察表明,對于不同的基因,表達量變動很大: 一般蛋白質(zhì)的表達量從 I m g / L 到超過170 m g /L ; 抗體的平均表達量為 20?40 m g /L ,但常常分布在兩個(木及)端。毫無疑問, 在表達載體設(shè)計、培養(yǎng)條件優(yōu)化和可能的細胞系改造方面, 我們還需要進一步的技術(shù)改進, 但這種方法總體上令人印象深刻的成功證明了這種努力是值得的。



    以上就是本期的內(nèi)容,更多資訊,歡迎點擊安培生物網(wǎng)站鏈接了解更多技術(shù)與產(chǎn)品資訊。


    安培生物科技有限公司介紹:

    安培生物堅持為生命科學(xué)研究、活體動物轉(zhuǎn)染、大規(guī)模生物生產(chǎn)、基因和細胞治療領(lǐng)域客戶,提供*細胞體內(nèi)可代謝的核酸轉(zhuǎn)染試劑;inviCELL™Platelet lysate無動物血清產(chǎn)品旨在支持廣泛的細胞擴增和生產(chǎn),包括培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞和多種免疫細胞系等,為制藥公司或者生物技術(shù)公司提供無血清細胞培養(yǎng)規(guī)模生產(chǎn)服務(wù);提供以植物生物為平臺基因序列全人源化、*的細胞培養(yǎng)可分解3D基質(zhì)膠產(chǎn)品;提供內(nèi)毒素≦ 1.0 EU/mL、對細胞無毒性影響、高純度的一型膠原蛋白產(chǎn)品。安培生物專注為生物醫(yī)藥領(lǐng)域提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品和技術(shù)服務(wù),努力發(fā)展為基因治療、細胞治療的生物科技企業(yè)。



產(chǎn)品中心 Products
羞耻美人妻HD中字电影 无码黄片免费观看 青青青国产色视频在线观看 色欲蜜桃AV无码中文字幕 国产精品无码福利无码网站 人妻无码专区一区二区三区 日韩va无码中文字幕不卡免费 日批视频在线免费观看 久久97久久精品自慰免费 三级电影在线观看免费 欧美人成片免费看视频不卡 拉屎popping大便网站 综合无码一区二区三区 人妻伦一区二区三区四区七区 香蕉精品亚洲二区在线观看 国产伦精品一区二区三区毛 亚洲国产精品成人综合色GIF 午夜欧美激情 欧美一级A免在线免费看 久久精品国产亚洲AV无码重庆 天天干狠狠操 中文字幕亚洲欧美专区不卡 午夜精品免费视频观看在线 中国人妻被两个老外三p 漂亮人妻去按摩被按中出 午夜福利在线不卡高清 日本高清不卡中文字幕 天天做天天爱天天爽 亚洲国产成人高清在线观看 无码黄片免费观看 理论片午午伦夜理片影院 老黄网站在线观看免费 人人妻人人狠人人爽天天综合网 肉动漫3d动漫在线观看 婷婷丁香五月花 男人超碰天堂怡红院 日韩精品视频中文字幕无码 日韩一区视频精品无高清在线观 免费看黄色毛片 无码1区2区在线观看 绯色精品人妻av一区二区三区 欧美精品产区一区二区 天天色天天射天天操 日韩欧美一区二区久久久 老太婆BBwwBBww高潮 九九热视频在线观看 国产成人午夜精品免费视频 亚洲精品中文字幕乱码三区不卡 欧美变态另类熟妇第一区 99这里有精品视频视频 人妻精品久久黄片 9久热久9爱免费精品视频 午夜欧美激情 91丝袜精品久久久久久无码人妻 人妻无码专区一区 免费在线黄色网址 日韩午夜理论片中文字幕 视频图片小说 亚洲一线产区二线产区精华 无套内射视频囯产 少妇特殊按摩高潮爽翻天 国产毛片无码在线 色哟哟在线观看精品大全视频 国产色诱视频在线播放丝袜 区二区三区四区免费视频 av高清无码免费一区 日韩精品一区二区三区不卡 手机在线亚洲精品不卡 第一次爱的人免费视频小说阅读 无限免费观看在线直播 乱色熟女一区二区 无码精品国应Aⅴ左线 奇米777狠狠色噜噜狠狠狠 午夜YY国产 人妻91无码精品一区二区内射 男人的好电视剧免费观看高清 中文字幕亚洲一区二区va 天堂无码人妻精品一区 久久精品噜噜噜成人AV 亚瑟在线无码 免费观看电视在线高胜算清 久草手机在线视频 日本精品久久免费观看 日韩亚洲欧美三区中文字幕 午夜性久久久性久久久久 系列专区无码免费看 波多野结衣精品视频 网站你懂我意思WWW正能量免费 色偷偷88888欧美精品久久 嗯啊在线看网站 香蕉视频色强 无套内射视频囯产 摸BBB揉BBB揉BBB视频 无码AⅤ在线精品手机版 亚洲精品在线视频观看 无码无遮挡在线看免费 探索小说天堂的惊奇世界 色婷婷一区二区三区免费 在线看免费看国产精品视频 妖精视频一区二区免费 日日躁夜夜找狠狠躁久久 午夜亚洲人人精品一区 色翁荡息又大又硬又粗又视频软件 人妻夜夜爽天天爽三区麻豆au 香蕉视频色强 免费在线观看的黄色视频 日本高清中文字幕二区在线 五月综合色丁香 国产网址在线观看 免费三片在线观看视频 被黑人巨鞭大战中国人妻视频 免费一级特黄特色大片最肥的 少妇人妻不卡777精品久久 挺进邻居人妻雪白的身体 深夜福利电影高清无码 鲁大师影院在线观看 久久91精品国产91久久久 污视频在线播放 免费国产一级片内射老妇 日本免费一区二区三区不卡网大全 蜜臀免费av 青青河边草免费观看高清电影 精品第一国产精品蜜芽 国产精品无码无卡A级毛片 日本水蜜桃身体乳的美白效果 欧美日韩国产一级在线视频 日韩精品一区二区三区vr 亚洲国产欧美在线观 日日噜噜夜夜狠狠扒开双腿 天海翼一区二区三区高清在线 久久影院午夜伦手机不四虎卡 鲁大师在线影院免费观看 蜜臀色欲久久无码精品 91福利国产在线播放午夜 手机在线观看不卡无码?v 无码熟妇人妻AV在线影片最多 久热精品在线中文字幕播放 日韩av线观看 无毒中文字幕无码高清 精品九九视频A视频在线观看 五月天在线视频国产在线二 无码午夜午夜精品一区二区三区 日日噜噜夜夜狠狠久久无码区 无码一区二区三区在线 99这里有精品视频视频 男同桌上课时狂揉我下面污文 无码电影在线观看国产 色偷偷无码中文字幕 亚洲欧洲自拍偷拍 日本免费一区二区三区不卡网大全 91精品国产自产社区 人妻丝袜无码专区视频网站 香蕉视频入口在线观看 亚洲一码二码三码精华液 亚洲精品无码AV中文永久在线 女人和公牛做了好大好爽 亚洲午夜久久影院 粉嫩极品国产在线观看 国产精品伦一区二区在线 最近更新中文字幕2022视频 日本黄色片网站 日本强伦姧人妻一区二区视 被黑人巨鞭大战中国人妻视频 免费真实播放国产乱子伦 爽a中文字幕一区 久久青草国产手机看片福利盒子 他的水蜜桃免费阅读全文小说 熟妇久久无码人妻av蜜臀 久久国产V一级毛多内射孕妇 欧美黑人一级爽快片婬片高清 亚洲.欧美.在线视频 少妇高潮ZZZZZZZYⅩ脱出 亚洲一线产区二线产区精华 亚洲国产精品张柏芝在线观看 免费纯色软件下载 太太其实你也很想要的对吧 欧美黑人肉体狂欢大派对 久久精品免费视频一区二区 四虎永久在线精品免费中文字幕 肉片无遮挡在线观看视频 欧美性爱网址 午夜精品免费福利 王者荣耀西施流眼泪翻白眼流口水的表情 日本边添边摸边做边爱 午夜毛片在线免费 欧美雌雄双性人交xxxx 午夜激情影院久最新av 日韩在线一区视频 婷婷丁香五月高清在线观看 婷婷丁香五月高清在线观看 欧美一曲二曲三曲的 公侵犯人妻二区三区中文字幕 好男人视频社区在线观看www 久久久一本二本三本 日本三级国产精品一卡两卡 日本亚洲欧洲免费无线码 了解最新久久成人十八免费网站 人人妻免费碰网视频 手机在线观看日韩AV 五月天丁香婷婷激情综合网 香蕉eeww99国产精选播放 日美欧韩一区二去三区 男女狂进狂出的动态图gif 毛片免费全部播放无码的视频 幸福宝8008app下载隐藏读书 精品综合亚洲色七久久 国产电影一区二区三区 欧美操逼视频大全 欧美人成片免费看视频不卡 欧美刺激又黄又爽视频 歪歪的漫画书雅思词汇 天天综合网免费在线播放 特黄特级A级黄毛片免费观看多人 日本韩国中文字幕 99精品高清在线播放 新久久国产色Av免费一级suv好看的国产网站 星光影院影院 国产色诱视频在线播放丝袜 无码不卡免费高清视频 日本人妻久久久中文字幕乱码 亚洲αⅤ无码专区国产乱码影院 可以免费看黄的网站 日本高清无卡码一区二区久久 庭院里的女人完整在线观看 精品婷婷乱码久久久久久蜜桃 十八禁在线观看视频 午夜福利男女XX00视频免费区 中文WWW新版资源在线 欧美日韩综合色免费大全 理论片午午伦夜理片久久 免费在线观看国产无码网站 扑克牌免费观看视频软件 中文字幕久久久久久久免费蜜桃麻豆 产后漂亮奶水人妻无码 国产又粗又黄又湿免费看视频 香蕉视频APP下载 欧美成人影视大全免费 无码专区第二页 性xx色xx综合久久久xx 日韩亚州欧美中文字幕 色欲av无码一区二区不卡 理论片午午伦夜理片影院 色视频一区二区三区 人妻制服丝袜中文字幕在线 毛片一区二区三区免费 在公车被灌强行满jing液视频 思思99热视屏 日韩黄色免费 日韩在线视频一区等最新内容! 久久人妻无码一区 强奷乱码中文字幕在线 99久久精品综合 国产美女视频网站 黄色小视频免费观看 欧美日韩国产亚洲图片成人网 麻豆av无码精品一区二区 国产精品国产免无码专区 中文字幕欧美久久久 人妻系列无码专区69影院 无码AV日韩一二三区 美丽的姑娘在线播放国语 久久国产乱子伦精品免费M 成人精品免费毛片7778 《睡美人》完整版在线观看 亚洲视频久久 日韩精品一区二区三区vr 久久无码一区二区三区桃花 91精品国产麻豆福利在钱 日本三级一区二区 无码精品午夜在线播放 小说区图片区视频区偷拍区 亚洲精品无码久久久久YW 中文WWW新版资源在线 偷偷做久久久久网站无码免费 亚洲av无码专区在线电影视色 苍井空波多野结衣AA片 欧美综合一区二区三区 毛片亚洲日韩国产一区 狠狠躁夜夜躁人人爽天天2020 日韩高清无码免费精品 欧洲亚洲国产日韩综合一区 女自慰喷潮免费观看www久久 精品一区二区久久 日韩欧美一区二区三区在线 手机免费无码av片在线观看 激情综合五月丁香亚洲 人妻夜夜爽爽88888视频 免费99精品国产自在首页 国产精品ⅤA在线观看 欧美精品国产日韩综合在线 色欲av无码在线观看 免费一级特黄特色大片最肥的 久久久久久亚洲精品人妻少妇 国产00粉嫩馒头一线天萌白酱 摸BBB揉BBB揉BBB视频 爽a中文字幕一区 亚洲精品夜夜夜 十大最污免费的软件下载 两个人高清视频免费观看 青柠影视西瓜视频在线观看 香蕉成人国产精品免费看网站 久久久久久久久久久大免费视频 96国产下药迷倒白嫩美女 人人超碰在线观看 鲁丝一区鲁丝二区鲁丝AV 成人影院三级日本波多野结衣电影 国产大学生情侣酒店视频 综合无码一区二区三区 国产专区免费资源网站 香焦性视频 婷婷五月精品中文字幕 国产精品视频久久久久久久久久 免费纯色软件下载 看三级片软件小视频 亚洲人成77777在线播放网站 中文字幕乱码人妻二区三区 小夫妻电视连续剧免费观看 日韩精品免费视频在线观看 欧美激情视频一区二区三区 亚洲一级无码免费视频 性生大片免费观看网站蜜芽 久久99热精品免费观看欧美 久久国产精品拍拍拍 午夜国产精品福利 噼里啪啦在线高清观看免费 国产伦精品一区二区三区毛 亚洲欧洲美洲无码精品 瞌睡的秘书像素游戏 欧美日韩产精品自在自线 欧美韩一区二区三区 青青草免费在线观看视频 手机看片国产免费永久 污黄网站在线观看 乱色熟女一区二区 免费无码一区二区三区蜜桃 黄色网页免费观看 国产91青青成人a在线 91福利国产在线播放午夜 97久久综合九色综合 亚洲手机国产精品第1页 人妻中文字幕在线专区 精品亚洲视频一区二区在线观看 国产一区麻豆VA传媒果冻精品 蜜臀精品国产91内射久久 日日噜噜夜夜狠狠久久无码区 拍精品AⅤ国产精品拍在线 国产亚洲精品久久无亚洲 无码成A毛片免费 老头猛挺进王进霞的体内 伦理影院在线免费观看
福建省| 阳谷县| 来宾市| 夏河县| 德保县| 西乌| 都江堰市| 敖汉旗| 深水埗区| 双流县| 腾冲县| 水富县| 琼结县| 英山县| 平南县| 丹阳市| 长丰县| 公安县| 金昌市| 桐城市| 铁力市| 洛扎县| 长岭县| 冕宁县| 马鞍山市| 宁津县| 科技| 井陉县| 云梦县| 赣榆县| 林芝县| 大竹县| 潞城市| 施秉县| 吉水县| 喜德县| 高雄县| 资兴市| 上蔡县| 云阳县| 齐齐哈尔市|