siRNA 表達(dá)載體的構(gòu)建

siRNA 表達(dá)載體構(gòu)建可以：

（1）作為后基因組時(shí)代基因功能分析的有力工具；

（2）應(yīng)用于基因組學(xué)、細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路分析；

（3）用于藥物靶點(diǎn)篩選、疾病治療。

實(shí)驗(yàn)方法原理: 

多數(shù)的 siRNA 表達(dá)載體依賴三種 RNA 聚合酶 III 啟動子(pol III)中的一種，操縱一段小的 發(fā)夾 RNA(short hairpinRNA, shRNA)在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)。這三類啟動子包括大家 熟悉的人源和鼠源的 U6 啟動子和人 H1 啟動子。之所以采用 RNA polIII 啟動子是由于它 可以在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)更多的小分子 RNA，而且它是通過添加一串（3 到 6 個(gè)）U 來終止轉(zhuǎn)錄的。要使用這類載體，需要訂購 2 段編碼短發(fā)夾 RNA 序列的 DNA 單鏈，退火， 克隆到相應(yīng)載體的 pol III 啟動子下游。由于涉及到克隆 ，這個(gè)過程需要幾周甚至數(shù)月的時(shí)間，同時(shí)也需要經(jīng)過測序以保證克隆的序列是正確的。

實(shí)驗(yàn)材料: 目的基因 

試劑、試劑盒：LB 培養(yǎng)基 

儀器、耗材：離心管、離心機(jī)、水浴鍋、漩渦振蕩儀等

一、目的基因的確定 

1. 檢索文獻(xiàn)獲取有實(shí)驗(yàn)證明有效的靶點(diǎn)序列（核對）。 

2. NCBI 查閱。 

3. 搜索引擎輔助：Google搜索引擎。

二 、設(shè)計(jì) siRNA 靶序列

在制備 siRNA 前都需要單獨(dú)設(shè)計(jì) siRNA 序列。研究發(fā)現(xiàn)對哺乳動物細(xì)胞,*的 siRNAs 是 21-23 個(gè)堿基大小、3’端有兩個(gè)突出堿基的雙鏈 RNA；而對非哺乳動物，比較有效的是長片段 dsRNA。siRNA 的序列專一性要求非常嚴(yán)謹(jǐn)，與靶 mRNA 之間一個(gè)堿基錯(cuò)配都 會顯著削弱基因沉默的效果。

1. 選擇 siRNA 靶位點(diǎn) 

從轉(zhuǎn)錄 AUG 起始密碼子開始，搜尋下游 AA 序列，記錄跟每個(gè) AA 3’端相鄰的 19 個(gè)核苷酸作為候選的 siRNA 靶位點(diǎn)。有研究結(jié)果顯示 GC 含量在 30%-50%左右的 siRNA 要比那 些 GC 含量偏高的更為有效。Tuschl 等建議在設(shè)計(jì) siRNA 時(shí)不要針對 5'和 3'端的非編碼區(qū) （untranslated regions,UTRs），原因是這些地方有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域，而這些 UTR 結(jié)合蛋白或者翻譯起始復(fù)合物可能會影響 siRNP 核酸內(nèi)切酶復(fù)合物結(jié)合 mRNA 從而影響 siRNA 的效果。

2. 序列同源性分析

將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫（人或者小鼠、大鼠等等）進(jìn)行比較,排除那些和其他 編碼序列/EST 同源的序列。例如使用 BLAST（ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）選出合適的目標(biāo)序列進(jìn)行合成.并非所有符合條件的 siRNA 都一樣有效,其原因還不清楚，可能是位置效應(yīng)的結(jié)果,因此對于一個(gè)目的基因，一般要選擇 3-5 個(gè)靶位點(diǎn)來設(shè)計(jì) siRNA。 通常來說，每個(gè)目標(biāo)序列設(shè)計(jì) 3-4 對 siRNAs，選擇*的進(jìn)行后續(xù)研究。

3. 設(shè)計(jì)陰性對照

一個(gè)完整的siRNA實(shí)驗(yàn)應(yīng)該有陰性對照，作為陰性對照的siRNA應(yīng)該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA中的堿基序列打亂。當(dāng)然，同樣要保證它和其他基因沒有同源性。

三、表達(dá)載體的選用

1. 化學(xué)合成與體外轉(zhuǎn)錄方法都是在體外得到 siRNA 后再導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，但是這兩種方法主要有兩方面無法克服的缺點(diǎn)：siRNA 進(jìn)入細(xì)胞后容易被降解；進(jìn)入細(xì)胞 siRNA 在細(xì)胞內(nèi)的 RNAi 效應(yīng)持續(xù)時(shí)間短。針對這種情況，出現(xiàn)了質(zhì)粒、病毒類載體介導(dǎo)的 siRNA 體內(nèi)表達(dá)。 該方法的基本思路是：將 siRNA 對應(yīng)的 DNA 雙鏈模板序列克隆入載體的 RNA 聚合酶 III 的啟動子后，這樣就能在體內(nèi)表達(dá)所需的 siRNA 分子。這種方法總體的優(yōu)點(diǎn)在于不需要直接操作 RNA，能達(dá)到較長時(shí)間的基因沉默效果。

2. 通過質(zhì)粒表達(dá) siRNAs 大都是用 Pol III 啟動子啟動編碼 shRNA(small hairpin RNA)的序列。選用 Pol III 啟動子的原因在于這個(gè)啟動子總是在離啟動子一個(gè)固定距離的位置開始轉(zhuǎn)錄合成 RNA，遇到 4—5 個(gè)連續(xù)的 U 即終止，非常精確。當(dāng)這種帶有 Pol III 啟動子和 shRNA 模板序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞時(shí)，這種能表達(dá) siRNA 的質(zhì)粒確實(shí)能夠下調(diào)特定基因的表達(dá)，可抑制外源基因和內(nèi)源基因。采用質(zhì)粒的優(yōu)點(diǎn)在于，通過 siRNA 表達(dá)質(zhì)粒的選擇標(biāo)記，siRNA 載體能夠更長時(shí)間地抑制目的基因表達(dá)。當(dāng)然還有一點(diǎn)，那就是由于質(zhì)?？梢詮?fù)制擴(kuò)增，相比起其它合成方法來說，這就能夠顯著降低制備 siRNA 的成本。

3. 帶有抗生素標(biāo)記的 siRNA 表達(dá)載體可用于長期抑制研究，通過抗性輔助篩選，該質(zhì)粒 可以在細(xì)胞中持續(xù)抑制靶基因的表達(dá)數(shù)星期甚至更久。同時(shí) RNAi-Ready 表達(dá)載體還能與逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒表達(dá)系統(tǒng)整合（BD Knockout RNAi Systems），大大提高 siRNA 表達(dá)載體對宿主細(xì)胞的侵染性,*克服某些細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低的障礙，是實(shí)現(xiàn)哺乳動物細(xì)胞 siRNAs 瞬時(shí)表達(dá)與穩(wěn)定表達(dá)的理想工具。

四、合成模板

1. 合成編碼 shRNA 的 DNA 模板的兩條單鏈，模板鏈后面接有 RNA PolyIII 聚合酶轉(zhuǎn)錄中止位點(diǎn)，同時(shí)兩端分別設(shè)計(jì) BamH I 和 Hind III 酶切位點(diǎn)，可以克隆到 siRNA 載體多克隆位點(diǎn)的 BamH I 和 Hind III 酶切位點(diǎn)之間。

2. 95℃，5 min，緩慢退火， DNA 單鏈得到 shRNA 的 DNA 雙鏈模板。

五、連接與轉(zhuǎn)化

1. 將 100 μl 感受態(tài)細(xì)胞于冰上解凍。

2. 取 5 μl 連接產(chǎn)物加入到感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕旋轉(zhuǎn)幾次以混勻內(nèi)容物，在冰上放置 30 分鐘。

3. 將管放入預(yù)加溫到 42℃的水浴中，熱激 90 秒?？焖賹⒐苻D(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻 1~2 分鐘。

4. 每管中加 700 μl LB 培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng) 1 小時(shí)，進(jìn)行復(fù)蘇。

5. 室溫 4000 rpm 離心 5 分鐘，棄去上清后，用剩余 100 μl 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并涂布到含抗性的 LB 瓊脂平板表面。注意：細(xì)胞用量應(yīng)根據(jù)連接效率和感受態(tài)細(xì)胞的效率進(jìn)行調(diào)整。

6. 將平板置于室溫直至液體被吸收。

7. 倒置平皿，于 37℃培養(yǎng)，12~16 小時(shí)后可出現(xiàn)菌落。

六、PCR 鑒定和測序鑒定

在插入編碼 shRNA 的 DNA 雙鏈模板兩側(cè)設(shè)計(jì)鑒定 PCR 引物，擴(kuò)增片段在 100-200bp 之間。

注意事項(xiàng)： 

1. 從轉(zhuǎn)錄本（mRNA）的 AUG 起始密碼開始，尋找“AA"二連序列，并記下其 3’端的 19 個(gè)堿基序列，作為潛在的 siRNA 靶位點(diǎn)。有研究結(jié)果顯示 GC 含量在 30%—50%左右 的 siRNA 要比那些 GC 含量偏高的更為有效。 Tuschl 等建議在設(shè)計(jì) siRNA 時(shí)不要針對 5’和 3’端的非編碼區(qū)（untranslated regions， UTRs)，原因是這些地方有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域，而這些 UTR 結(jié)合蛋白或者翻譯起始復(fù)合物可能會影響 siRNP 核酸內(nèi)切酶復(fù)合物結(jié)合 mRNA 從而影響 siRNA 的效果。

2. 將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫（人，或者小鼠，大鼠等等）進(jìn)行比較，排除那些和其他編碼序列/EST 同源的序列。 

3. 選出合適的目標(biāo)序列進(jìn)行合成。通常一個(gè)基因需要設(shè)計(jì)多個(gè)靶序列的 siRNA，以找到*的 siRNA 序列。

4. 一個(gè)完整的 siRNA 實(shí)驗(yàn)應(yīng)該有負(fù)對照，作為負(fù)對照的 siRNA 應(yīng)該和選中的 siRNA 序列有相同的組成，但是和mRNA沒有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA序列打亂， 同樣要檢查結(jié)果以保證它和其他基因沒有同源性。

如果計(jì)劃合成 siRNA，那么可以直接提供以 AA 打頭的 21 個(gè)堿基序列，廠家會合成一對互補(bǔ)的序列。注意的是通常合成的 siRNA 是以 3’dTdT 結(jié)尾，如果要 UU 結(jié)尾的話通常要特別說明。有結(jié)果顯示，UU 結(jié)尾和 dTdT 結(jié)尾的 siRNA 在效果上沒有區(qū)別。因?yàn)檫@個(gè)突出端無需和靶序列互補(bǔ)。

其他：

siRNA 操作成功要點(diǎn)

1. 對每個(gè)基因設(shè)計(jì)并檢測兩到四個(gè) siRNA 序列為了找到潛在靶位點(diǎn)，掃描靶基因中的 AA 序列。記錄每個(gè) AA 3’端 19 個(gè)核苷酸作為潛在 siRNA 靶位點(diǎn)。潛在靶位點(diǎn)需通過 GENBANK 數(shù)據(jù)庫的 BLAST 分析，去除那些與其它基因明顯同源的靶位點(diǎn)。如果可能，siRNA 應(yīng)根據(jù) mRNA 低二級結(jié)構(gòu)的區(qū)域設(shè)計(jì)。 

2. 選擇低 GC 含量的 siRNA 

研究發(fā)現(xiàn) GC 含量在40-55%的 siRNA 比55%以上的活性高。

3. 純化體外轉(zhuǎn)錄 siRNA 

在轉(zhuǎn)染前要確認(rèn) siRNA 的大小和純度。為得到高純度的 siRNA，推薦用玻璃纖維結(jié)合，洗脫(siRNA 體外合成試劑盒中已包括純化柱保證 siRNA 純度)或通過15-20%丙烯酰胺膠除去反應(yīng)中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和鹽離子。注意：化學(xué)合成的 RNA 通常需要跑膠電泳純化(即 PAGE 膠純化)。

4. 避免 RNA 酶污染 

微量的 RNA 酶將導(dǎo)致 siRNA 實(shí)驗(yàn)失敗。由于實(shí)驗(yàn)環(huán)境中 RNA 酶普遍存在，如皮膚，頭發(fā)， 所有徒手接觸過的物品或暴露在空氣中的物品…因此保證實(shí)驗(yàn)每個(gè)步驟不受 RNA 酶污染非常重要。如除 RNA 酶的噴劑，拭紙及液劑，檢測和去除 RNA 酶。

5. 健康的細(xì)胞培養(yǎng)物和嚴(yán)格的操作確保轉(zhuǎn)染的重復(fù)性通常，健康的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較高。此外，較低的傳代數(shù)能確保每次實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞的穩(wěn)定性。 為了優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，推薦用 50 代以下的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，否則細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率會隨時(shí)間明顯下降。 

6. 避免適用抗生素推薦從細(xì)胞種植到轉(zhuǎn)染后 72 小時(shí)期間避免使用抗生素?？股貢诖┩傅募?xì)胞中積累毒素。有些細(xì)胞和轉(zhuǎn)染試劑在 siRNA 轉(zhuǎn)染時(shí)需要無血清的條件。這種情況下，可同時(shí)用正常培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基做對比實(shí)驗(yàn)，以得到最佳轉(zhuǎn)染效果。Zeta Life 公司推出的專門針對 RNA 轉(zhuǎn)染的試劑Zeta Life Advanced DNA RNA Transfection Reagent（Zeta Life高效DNA、RNA轉(zhuǎn)染試劑）

7. 選擇好的轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染 siRNA 針對靶細(xì)胞類型，選擇好的轉(zhuǎn)染試劑和優(yōu)化的操作對 siRNA 實(shí)驗(yàn)的成功至關(guān)重要。siRNA 實(shí)驗(yàn)要求選擇適合轉(zhuǎn)小的 RNA 的轉(zhuǎn)染試劑(目前大多數(shù)轉(zhuǎn)染試劑都針對轉(zhuǎn)染比較大的質(zhì)粒 DNA，而非小的 RNA 分子，宿主范圍大小也不同)。Zeta Life 公司的 Zeta Life Advanced DNA RNA Transfection Reagent（Zeta Life高效DNA、RNA轉(zhuǎn)染試劑）都是專門針對轉(zhuǎn) siRNA 優(yōu)化的轉(zhuǎn)染試劑，是理想選擇。

8. 通過合適的陽性對照優(yōu)化轉(zhuǎn)染和檢測條件對大多數(shù)細(xì)胞，看家基因是較好的陽性對照。將不同濃度的陽性對照的siRNA轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞(同樣適合實(shí)驗(yàn)靶siRNA)，轉(zhuǎn)染 48 小時(shí)后統(tǒng)計(jì)對照蛋白或 mRNA 相對于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的降低水平。過多的 siRNA 將導(dǎo)致細(xì)胞毒性以至死亡。

9. 通過陰性對照 siRNA 排除非特異性影響 合適的陰性對照可通過打亂活性 siRNA 的核苷酸順序設(shè)計(jì)而得。必須注意它要進(jìn)行同源比較確保相對所要研究的生物的基因組沒有同源性。

10. 通過標(biāo)記 siRNA 來優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 

熒光標(biāo)記的 siRNA 能用來分析 siRNA 穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染效率。標(biāo)記的 siRNA 還可用作 siRNA 胞內(nèi)定位及雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)(配合標(biāo)記抗體)來追蹤轉(zhuǎn)染過程中導(dǎo)入了 siRNA 的細(xì)胞，將轉(zhuǎn)染與靶蛋白表達(dá)的下調(diào)結(jié)合起來。